Charles Dumoulin descendait d'une famille noble, alliée à Anne Boleyn, mère de la reine Élisabeth Ire d'Angleterre. II fut reçu avocat au parlement de Paris en 1522 mais, n'ayant pu vaincre un bégaiement auquel il était sujet, il se retira du barreau et se consacra aux travaux du cabinet.

Les Observations sur l'édit de Henri II relatif aux petites dates, qu'il publia en 1551 et où il soutenait que le roi avait le droit de réprimer les abus et les fraudes qui se commettaient à Rome dans la distribution des bénéfices, lui valut les bonnes grâces de Henri II, mais donna lieu à de vives réclamations de la part du Saint-Siège.

Dumoulin avait embrassé le calvinisme, puis l'avait abandonné pour le luthéranisme. Inquiété pour ses opinions, il se réfugia en Allemagne, où il fut reçu avec la plus grande distinction. Après avoir enseigné à l'université de Dole en 1555 et 1556, il revint à Paris en 1557, mais ce fut pour y subir de nouvelles tribulations.

Ayant publié en 1564 un ouvrage intitulé : Conseil sur le concile de Trente, dans lequel il voulait prouver que ce concile était nul, il fut jeté en prison et ne recouvra sa liberté qu'à la condition de ne plus rien publier sans la permission du roi.

Charles Dumoulin trouva le premier les véritables sources du droit français et en posa les règles fondamentales : il a commenté les principales coutumes de France ; sa Révision de la Coutume de Paris passe pour un chef-d'œuvre. La meilleure édition de ses œuvres selon le Dictionnaire Bouillet est celle de Paris, 1681, 5 volumes in-folio.

Il fut inhumé dans le cimetière Saint-André-des-Arts à Paris.